-蛋白凝胶的酸性银染法

-蛋白凝胶的酸性银染法_生物化学实验指导

    实验七　SDS-PAGE蛋白凝胶的酸性银染法

    【实验目的】

    1．掌握银染法的基本原理。

    2．了解银染法与考马斯亮蓝染色方法的应用。

    【实验原理】

    银染法可分为酸性银染法和碱性银染法。酸性银染法原理为酸性环境下银离子能渗入凝胶与蛋白质-SDS复合物相结合，并附着在蛋白质分子表面。随后在碱性环境中甲醛的作用下，银离子可还原为金属银析出，因而使蛋白条带显现出黑色斑点或条带。银染法极为灵敏，灵敏度与考马斯亮蓝染色方法相比高出约100～1000倍，可检测最低0．1～1 ng的蛋白肽段。因为灵敏度过高，使用过程中需注意避免杂蛋白质污染，具体措施包括:所有溶液均用超纯水配制;所用器皿需用去污剂彻底清洗干净;染色全程必须戴手套;严格控制染色时间等。

    【实验器材】

    玻璃或金属平皿4个、玻璃量筒、烧杯、玻璃吸管若干。

    【药品试剂】

    1．固定液:含50%乙醇，12%醋酸，0．1%甲醛(临用前加)。

    2．漂洗液:50%乙醇。

    3．致敏液:0．02%硫代硫酸钠。

    4．染色液:含0．5%硝酸银和0．075%甲醛(临用前加)。

    5．显色液:含6%碳酸钠，0．0004%硫代硫酸钠，0．05%甲醛(临用前加)。

    6．中止液:含50%乙醇和12%醋酸。

    【实验方法】

    1．配制固定液，置于平皿中。

    2．戴手套用剥胶器或刀片小心分开两玻璃板，将上部的浓缩胶部分划开弃去，取10 ml注射器吸取电泳液，插入玻璃板与凝胶之间注入，使水的压力将两者自然分开，边推边进，反复多次注水，直至凝胶从玻璃板上滑落下来。将凝胶置于固定液中，摇床上轻微振荡，常温固定1小时;

    3．将凝胶转移至另一平皿中，加入漂洗液漂洗，每隔5分钟换液，共三次;

    4．倒去漂洗液，加入致敏液反应1分钟，然后迅速倾去致敏液，加入双蒸水漂洗，每隔1分钟换液，共三次;

    5．倒去液体，加入染色液，摇床上轻微振荡，常温下染色20分钟;

    6．双蒸水漂洗3次，每次1分钟;

    7．倒去液体，加入显色液，摇床上轻微振荡，常温下显色4～15分钟，显色时间以肉眼可见清晰蛋白条带为准。

    8．直接在显色液中迅速加入反应中止液，迅速摇晃以让液体能均匀混合，使得凝胶显色均匀。

    【思考题】

    1．简述银染法的使用范围。

    2．试分析银染法的影响因素和注意事项。