焦磷酸测序数据分析流程

    第四节　焦磷酸测序技术

    最近，新一代DNA序列分析技术——焦磷酸测序技术由于具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点，已应用于基因多态性分析。焦磷酸测序技术是由Ronaghi等经多年的研究发展起来的一种新型的DNA测序技术，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。作为新一代DNA序列分析技术，对DNA的序列分析不需要平板胶或毛细管电泳，DNA片段也无须荧光标记，不需要荧光激发和检测装置，操作相对简便。该技术主要通过4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。 PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。但目前只能测定一段较短的目标片段，20～40bp的序列，比DNA自动测序技术短。赵锦荣等应用焦磷酸测序技术，建立耐利福平结核分枝杆菌快速检测方法，在所分析的利福平敏感株中均未检测到rpoB耐药决定区突变，而在耐利福平菌株中均检测到耐药决定区突变，常见突变位点为531和526密码子。Isola等应用焦磷酸测序技术，建立耐EMB结核杆菌快速检测方法，均获得较好的结果。