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质粒的电泳检查

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质粒的电泳检查

质粒的电泳检查_分子生物学实验指

    实验二 质粒DNA的电泳检查

    一、实验目的

    掌握琼脂糖凝胶电泳的原理,学习琼脂糖凝胶电泳的操作。

    二、实验原理

    DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH值的溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

    三、实验仪器、材料与主要试剂

    1.仪器

    恒温培养箱、琼脂糖凝胶电泳系统、台式离心机、高压灭菌锅、紫外核酸检测仪

    2.材料

    DNA marker、pUC18质粒

    3.试剂

    (1)50×TAE(50倍体积的TAE贮存液)

    配1000mL 50×TAE:

    Tris          242g

    冰醋酸         57mL

    0.5mol/L EDTA     200mL

    pH 8.0

    (2)凝胶加样缓冲液   (6×)

    溴酚蓝         0.25%

    蔗糖          40%

    (3)琼脂糖

    (4)溴化乙锭溶液(EB)  0.5μg/mL

    四、实验步骤

    1.制备琼脂糖凝胶

    按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表:

    

    称取1.0g琼脂糖,放入锥形瓶中,加入100mL 1×TAE缓冲液,置微波炉或水浴加热至完全溶化,取出摇匀,则为1%琼脂糖凝胶液。

    2.胶板的制备

    (1)取干净的有机玻璃内槽,用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严,不能留缝隙)。

    (2)将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并放好样品梳子。

    (3)将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。

    (4)待胶凝固后,取出梳子,撕下透明胶带,放在电泳槽内。

    (5)加入电泳缓冲液至电泳槽中。

    3.加样

    用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。

    4.电泳

    (1)接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极,DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比,最高电压不超过5V/cm。

    (2)当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处时,停止电泳。

    5.染色

    将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1×TAE缓冲液中加两滴溴化乙锭储存液即可)。注意:溴化乙锭为致癌物,须戴一次性塑料薄膜手套操作,并小心不要污染环境。

    五、实验结果

    在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出橘红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜,紫外线对眼睛有伤害作用)。

    六、思考题

    1.影响带电颗粒在电场中泳动速度的影响因素有哪些?

    2.凝胶电泳有哪些用途?用它怎样鉴定样品纯度?

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