一般毒性试验

    

    一般毒性试验，包括不同种属动物和不同给药途径进行急性毒性试验、反复多次的长期毒性试验，观测其具广谱性和不确定性特点的毒性指标，如生理学、血液学、血液生化学及病理形态学的综合性指标。

    （一）急性毒性试验

    1．目的 急性毒性试验（acute toxicity test，single dose toxicity test）是指动物在一日内单次或多次（化学药品1～2次，中药、天然药物3～4次）接受过量药物后，至少连续14d内观察所产生的毒性反应或死亡情况，急性毒性试验一方面可了解其中毒表现，毒性反应出现和消失的时间过程，其毒性靶器官是什么，并可分析中毒死亡的原因；另一方面可观察药物毒性反应与药物剂量间的关系，从而可获得致死量（lethal dose，LD）、近似致死量（approximate lethal dose，ALD）和半数致死量（lethal dose 50，LD50）。因此，剂量和反应间的曲线斜率和试验动物的反应类型，对其危害人类健康的评价是很好的参考。

    2．试验方法 有经典半数致死量法（LD50测定法）、最大给药量法（限度试验）、固定剂量法、近似致死量法、累积剂量（“金字塔”研究）设计法及序贯法（上下法）等。对于不同受试物来讲，由于其化学成分及化学结构、活性成分含量的差异，造成其毒性强度的必然差异，因此，需根据受试物特点选择试验方法。

    （1）灌服及注射给药急性毒性试验：是指动物经肠或注射（皮下、肌内、静脉）给药的毒性试验。一般常用健康7～9周龄啮齿类（小鼠、大鼠）和6～8月龄非啮齿类（犬、猴）动物进行试验。灌服及注射给药急性毒性试验的主要方法有：①LD50的测定，通常设置5～6个剂量组，小动物每组10只以上，大动物每组6～8只，每组雌雄各半，根据不同动物选择适宜的给药容量（小鼠：灌服、静注、腹腔注射、皮下注射，分别为0．5～0．8、0．5、0．5和0．5ml。大鼠上述各给药途径分别应小于或等于3．0、1．0、3．0和1．0ml）。②最大耐受剂量与最大给药剂量试验，两试验法均是指采用10～20只动物，单次给药后，前者是能引起动物明显中毒反应而未发生死亡的剂量；后者是在合理的药物浓度和给药容量的条件下，以允许的最大剂量（化学药品口服为5．0g／kg，注射为2．0g／kg），观察实验动物出现的反应。③固定剂量法是指以动物出现明显毒性体征作为终点进行评价，一般首选大鼠，以临床拟用途径单次给予5、50、500、2 000mg／kg中的任一个剂量为初始剂量，作预试验，若无参考资料可用500mg／kg作初始剂量，如无毒性反应，则用2 000mg／kg试验，若无死亡发生，即可结束预试验。若该剂量出现严重毒性反应，可用下一个档次的剂量进行试验，若存活，则在此两剂量间选一剂量试验，每个剂量一只动物，给药后观察需连续7d；而两剂量间试验时间应隔24h以上；在预试验的基础上选择上述四种剂量中可能产生明显毒性而又不引起死亡的剂量进行正式实验，每个剂量组10只动物，雌雄各半，给药后至少观察两周，亦可根据毒性反应的具体特点而适当延长，对每只动物均应仔细观察和详细记录各种毒性反应出现和消失的时间。

    （2）急性皮肤毒性试验：是观察动物完整或破损皮肤接受单剂量（中药制剂视情况亦可一日内多剂）受试物后，短期内（一般为7～14d）出现的毒性反应及死亡情况，常选用大鼠（中药制剂不选用）、白毛豚鼠和兔或小型猪，脱毛面积约为动物体表面积的10%，破损皮肤以渗血为度，通常需3个剂量组，每组至少5只同性别动物。实验结果判断，对死亡或濒死动物需尸解，可疑病理改变器官则需进行病理组织学检查。也可采用雌雄动物各5只，一次剂量至少2．0g／kg，并未产生毒性反应或死亡的限量试验。

    （3）急性吸入性毒性：是指动物在24h以内，经一次性连续吸入气态、挥发性、气雾剂或微粒等受试物后，动物所出现的毒性反应。一般选用大鼠或豚鼠，应设3个剂量组，每剂量组雌雄各5只，动物全身暴露于不超过20L具有不间断空气流速的特制容器内，置于容器时间至少是受试物在容器中达平衡后4h，观察期至少14d，逐日观察动物的全身反应，死亡或濒死动物应进行尸解，14d后处死动物，对呼吸道进行大体解剖观察，如果有迹象表明毒性涉及其他器官，则应进行病理检查。若受试物浓度已达5mg／L或以上，接触4h仍未发生毒性反应，则不需设三个剂量组。急性吸入性毒性也可用半数致死浓度（IC50）表示，结果以标准容器中所含受试物的重量（mg／L）或以百万分率（ppm）表示。

    （二）长期毒性试验

    长期毒性试验是观察反复给动物受试物后，所产生的毒性反应及其严重程度，提供无毒性反应剂量和临床主要监测指标，为制定临床试验和人用安全剂量提供参考。根据受试药物临床拟采用的给药途径不同，试验方法可分为以下三种：

    1．经胃肠或注射给药 一般选用啮齿类SD或Wistar大鼠与非啮齿类Beagle犬或猴两类动物，动物年龄选择应依试验周期的长短而定，在此前提下，通常大鼠为6～9周龄，Beagle犬为6～12个月龄，大鼠每组雌雄各10～30只，犬或猴每组雌雄各3～6只；给药途径原则上应与临床拟用给药途径相同；一般应设受试物三个剂量组和一个正常对照组或溶媒、赋形剂组。低剂量组原则上应高于同种动物药效的有效剂量，而动物不出现毒性反应，高剂量组原则上能使动物产生明显或严重的毒性反应，在高、低剂量间再设一个中剂量组（应相当于药效学试验的高剂量）；试验周期的确定应根据临床拟用疗程长短而定，化学药品可参照表4-1所列时间，中药可为临床拟用疗程的3～4倍的时间；试验观察指标包括饲料消耗量、体重变化、外观体征及行为活动、血液学指标、血液生化学指标、体温（非啮齿类动物）、眼科检查（非啮齿类动物）、尿常规分析指标（非啮齿类动物）、心电图（非啮齿类动物）、重要组织和器官的脏器系数及肉眼和病理观察，给药期满后24h可活杀部分动物检测各指标，余下动物可作为延迟性毒性或已出现的毒性反应的可逆性的恢复期观察，恢复期的长短依据受试物代谢动力学、靶器官或靶组织的毒性反应及恢复情况确定。

表4-1　药物长期毒性试验给药周期

    

    2．皮肤给药 观察动物皮肤长期接触受试物，受试物在用药局部和经皮肤吸收后在全身产生毒性反应的可能性及其严重程度。该试验常用动物为成年健康兔（2．0～3．0kg）、豚鼠（350～450g）和大鼠（200～300g），部位常选择背部皮肤，试验期间每周脱毛一次，给药皮肤面积约占体表面积的10%（兔150cm2、豚鼠和大鼠40cm2）。一般应设三个受试物剂量组和一个对照组或赋形剂组，其中高剂量组应产生毒性反应，低剂量组不应出现任何毒性反应，中剂量组允许动物出现轻微的毒性反应。若受试物剂量已超过1．0g／kg或达有效浓度20倍以上，仍未见毒性反应和死亡时，则只需设一个高剂量组。每个剂量组兔雌雄各6只，大鼠、豚鼠雌雄各10只。

    3．角膜、黏膜或吸入给药 眼、口腔、阴道、直肠等反复多次给药的长期毒性或长期吸入性毒性试验，其要求基本上与皮肤给药长期毒性试验相同。