微生物多糖结冷胶脱蛋白研究_砺行生命科学
实验八 微生物多糖结冷胶脱蛋白研究
一、目的要求
去除结冷胶发酵液中的菌体碎片和蛋白质，得到澄清的结冷胶。
二、基本原理
近年来，随着微生物多糖应用领域的不断拓展，微生物多糖的市场需求量越来越大。在众多的微生物多糖中，结冷胶以其独特的分子结构决定了其众多卓越的理化性能，如用量低、透明度高、耐酸、耐高温、耐酶、兼容性好等，在食品、制药、化工等行业以触变剂、稳定剂、增稠剂、乳化剂和凝胶剂等被广泛应用。然而，由于结冷胶发酵液属于高黏度反应体系，不仅使营养物质的供应成为提高发酵效率的限制因素，而且极大地增加了后提取的难度。去除结冷胶发酵液中的菌体碎片和蛋白质，得到澄清的结冷胶是提取过程中需要解决的技术难题之三。该步骤不仅影响产品纯度，也是影响产品外观和应用性能的关键所在。()
Folin-酚法与考马斯亮蓝法都是测定样品中微量蛋白质的常用方法。Folin-酚法的测定灵敏度略低于考马斯亮蓝法，但是却在测定成本及可重复性方面优于考马斯亮蓝法，并且对于黏度较大的结冷胶样品没有聚集沉淀作用。
三、器材
1.主要试剂
氯仿、正丁醇、食品级乙醇、结晶牛血清白蛋白、Folin-酚甲试剂和Folin-酚乙试剂。
2.主要仪器
冷冻干燥机，低温离心机，722分光光度计，电子分析天平，恒温箱（5～50℃），电子天平（精确至0.001g），凝胶强度仪，水浴锅（室温约100℃），标准筛:80目，高速搅拌器，酸度计，灰化炉，电炉，干燥器，瓷坩埚，电子天平。
四、操作步骤
1.蛋白质含量测定:Folin-酚法
（1）标准蛋白质溶液的配制
称取适量牛血清白蛋白样品，用三蒸水配成浓度为100μg/mL的水溶液。
（2）Folin-酚甲试剂的配制
使用前将4%Na2CO3与0.2mol/L NaOH等体积配制Na2CO3-NaOH溶液，将1% CuSO4与2%酒石酸钾钠溶液等体积配制CuSO4-酒石酸钾钠溶液，然后将这两种试剂按50∶1的比例混合，即成Folin-酚甲试剂。
（3）标准曲线的绘制
取配好的标准蛋白质溶液0.0mL，0.1mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL加于10mL试管中，再分别加入1.0mL，0.9mL，0.8mL，0.6mL，0.4mL，0.2mL，0.0mL三蒸水及5mL Folin-酚甲试剂，混匀并在室温（20～25℃）下静置10min后，加入0.5mL Folin-酚乙试剂，于30℃水浴中保持30min，最后在640nm处测其吸光度，并以牛血清白蛋白的量（μg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。
（4）样品测定
取样品溶液0.2mL或0.4mL加于10mL试管中，加入0.8mL或0.6mL三蒸水及5mL Folin-酚甲试剂，混匀并在室温下静置10min后，加入0.5mL Folin-酚乙试剂，于30℃水浴中保持30min，最后在640nm处测其吸光度（以蒸馏水作为空白对照），根据标准曲线计算蛋白含量。
2.多糖含量测定:硫酸-苯酚法
（1）标准葡萄糖溶液的配制
称取干燥葡萄糖20mg，用三蒸水配成浓度为200μg/mL的水溶液，再将其分别稀释至浓度为40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL、140μg/mL、180μg/mL。
（2）标准曲线的绘制
取标准葡萄糖溶液各0.2mL加于10mL试管中，加入5%的苯酚0.4mL，混匀后，迅速加入2mL浓H2SO4，再次混匀后，于沸水浴中保持15min，最后在490nm处测其吸光度（以蒸馏水作为空白对照），并以葡萄糖溶液的浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。
（3）样品测定
取样品溶液0.2mL加于10mL试管中，按照以上标准曲线的测定方法进行样品溶液中多糖含量的测定，根据吸光度和标准曲线计算样品溶液中总糖含量。
3.结冷胶粗品溶液的制备
称取自制低酰基结冷胶粗品粉末若干，溶于适量去离子水中使之浓度为0.4%。经50℃水浴振荡2h后，于8 000r/min离心5min，取上清液，即为结冷胶粗品溶液。
4.Sevag法除蛋白
本实验使用Sevag法去除结冷胶粗品中的蛋白质，氯仿和正丁醇按4∶1比例配制成混合溶液，即为Sevag试剂。反应体系选用50mL离心管，内含30mL 0.4%（w/v）结冷胶粗品溶液。加入1/3体积的Sevag试剂，振荡30min，于4 000r/min离心5min后，取上清液置于另一离心管中，此为使用Sevag去除蛋白质一次。重复前述操作可继续进行多次去除。本实验用Sevag法去除7次。最后再用Folin-酚及苯酚硫酸法测定样品中的蛋白质及总糖含量。
5.结冷胶凝胶透光率测定方法
取0.6g样品于250mL烧杯中，加蒸馏水120mL，称量并记录总量，将烧杯置于80℃水浴，加热期间用玻璃棒间断搅拌3次，加热20min后至样品全部水化，边搅拌边加2.7%的氯化钙溶液2mL，取出烧杯，快速擦干外壁，称量，补充蒸发水量至原总量，搅拌均匀。趁热将胶溶液倾入10mm比色皿，立即放入20℃恒温箱中，放置15min。用722分光光度计在497nm处测定透光率，用蒸馏水对照。做三个平行样品，取平均值。
6.结冷胶干燥失重的测定方法
烘干法 取供试品1～5g，平铺于干燥至恒重的扁形称瓶中，厚度不超过5mm，疏松供试品不超过10mm，精密称定重量，打开瓶盖在100～105℃干燥5h，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30min，精密称定重量，再在上述温度干燥1h，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量（%）。
7.结冷胶pH的测定方法
取5g样品置于装有500mL蒸馏水的烧杯中，用高速搅拌器搅拌至全溶，在20℃温度下用酸度计测定其pH（精确至0.1pH单位）。
五、实验报告
记录并计算各种测定数据。
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