同位素标记示踪法

    同位素标记示踪法(isotope label trace assay)是在被测分子上标记放射性同位素来区分内源性物质与外源性物质，再借助液闪仪等放射性探测设备读取生物样品的放射性计数，以此推断标记药物的血药浓度的分析方法。所使用的同位素有3H、14 C、32 S、125 I等，125 I因其放射性高、半衰期适宜、标记制备简单而最为常用。标记方法有两种，一种是内标法，即把含有同位素的氨基酸加入生长细胞或合成体系，该法对生物活性的影响较小，但由于制备复杂而限制了其广泛应用;二是外标法，最常用的化学方法如氯胺T或Lodogen法将125 I连接于大分子上，因相对简单而被首选。同位素标记失踪法灵敏度高、并能同时了解标记药物在生物体内的吸收、分布、排泄，因此在生物技术药物的组织分布分析上具有极为突出的优势。Plech等用同位素125 I标记的白细胞焦激肽研究其在大鼠脑部和内脏器官中的分布，发现其在肾上腺、下丘脑和大脑海马部位有很高的积聚。

    同位素示踪法最大的瓶颈在于蛋白质多肽类药物进入生物体后会被降解代谢，生成的标记氨基酸可再重新合成蛋白质，或与其他蛋白质结合，所以总的放射性强度不能代表生物大分子药物的体内过程。因此同位素标记示踪常与其他分离手段，如SDS－PAGE、HPLC技术联用。王秀琴等采用同位素标记示踪法结合SDS－PAGE电泳法测定小鼠G蛋白抑制肽GCIP－27的血药浓度，125 I－GCIP采用氯甘脲法标记，标记率为93.27%，比活度为688.2 kBq·μg－1，标记后的125 I－GCIP经测定生物活性没有明显降低;将125 I－GCIP与未标记的GCIP配制成系列浓度溶液后，利用SDS－PAGE电泳分离，考马斯亮蓝染色后，切割胶条置入测定管进行γ计数。方法线性良好，最低定量限为2.0μg·L－1。姜国华等人利用同位素示踪法研究125 I－NGF在小鼠体内的吸收、分布及排泄。实验采用同位素示踪法与电泳法相结合，不仅具有较高的分辨率、灵敏度和准确性，而且可以准确识别原型药物。同位素标记示踪法与HPLC法结合可增强前者方法的特异性，应用非常广泛，不同类型的高效液相色谱法可以根据不同的原理分离样品中的待测组分，同时测定原药和降解产物，其中体积排阻HPLC可得到有关结合物的信息。Visich等利用体积排阻HPLC法分离定量125 I标记重组人凝血酶－内源性抑制子复合物、125 I标记重组人凝血酶和游离的125 I，结果显示不管是静脉给药还是皮下给药，重组人凝血酶都会很快结合到内源性抑制子上，并在肝脏积聚后被清除。