蛋白质浓度的测定实验报告

双缩脲法_生物化学实验

    一、双缩脲法

    （一）实验目的

    1．了解双缩脲法测定蛋白质浓度的基本原理。

    2．熟悉双缩脲法测定蛋白质浓度的实验方法。

    （二）实验原理

    凡具有两个或两个以上肽键的化合物，均能在碱性溶液中与Cu²⁺形成紫红色络合物，即双缩脲反应，此络合物颜色的深浅与该化合物浓度成正比。蛋白质分子具有多个肽键，因此具有双缩脲反应，故可以通过比色来测定蛋白质的浓度。双缩脲反应见实验三中双缩脲反应。

    （三）实验药品、实验设备

    1．鸡蛋清：鸡蛋清用蒸馏水稀释，使其蛋白质浓度在标准曲线测试范围内。

    2．10g/L酪蛋白标准液：酪蛋白要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，再根据其纯度称量，用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制。

    3．双缩脲试剂：精确称取五水合硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）3.0g、酒石酸钾钠（NaKC4H₄O₆·4H₂O）9.0g及碘化钾（KI）5.0g，各自分别溶于25mL蒸馏水中。将酒石酸钾钠溶液和碘化钾溶液倒入1000mL容量瓶中，加24％氢氧化钠溶液100mL混匀。再加五水合硫酸铜溶液，边加边摇，最后加水定容至1000mL。贮存于塑料瓶内（或内壁涂石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需重新配制。

    4．电热恒温水浴箱（37℃）。

    5．分光光度计。

    6．15mm×150mm试管8支。

    7．1mL、2mL、5mL刻度吸管。

    8．试管架。

    9．1000mL容量瓶。

    （四）实验方法

    1．标准曲线的绘制

    取6支试管编号，按表2-9所示顺序和剂量加入试剂。

    表2-9　标准曲线的绘制

    

    加完上述试剂后混匀，在37℃或室温下放置20min后，用分光光度计在波长540nm下，以“0”管作空白，测定各管吸光度。

    以各吸光度为纵坐标，各标准蛋白浓度为横坐标，绘制吸光度-蛋白质浓度标准曲线。

    2．样品测定

    取两支试管编号，按表2-10所示顺序和剂量加入试剂。

    充分混匀，在37℃或室温下放置20min，用分光光度计在波长540nm下，以空白管调零，测定测定管吸光度。

    表2-10　样品测定

    

    3．结果处理

    根据测定管吸光度，从标准曲线上查出蛋白质的浓度，再乘以血清稀释倍数10，即为血清中的蛋白质浓度。

    4．注意事项

    （1）须于显色后30min内比色，30min后有雾状沉淀产生。同时注意各管从显色到比色的时间应尽可能一致。

    （2）避免硫酸铜过量，否则生成氢氧化铜蓝色而掩盖紫红色，影响测定结果。

    （3）待测样品若含有大量脂肪物质，会产生混浊的反应混合物，亦影响测定结果。这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。

    （4）双缩脲反应并非蛋白质特有的颜色反应，凡有肽键的物质均干扰此反应。

    （五）实验记录

    1．吸光度-蛋白质浓度标准曲线的绘制。

    2．实验记录：

    

    （六） 思考题

    1．干扰本实验的因素有哪些？

    2．双缩脲法有何特点？