靶基因的鉴定

    由于计算机模拟在预测miRNA靶基因时存在一定的局限性，利用生物学实验方法可以更加直观地寻找miRNA靶基因。目前主要是从mRNA水平与蛋白质水平来寻找靶基因。从mRAN水平来寻找靶基因主要是通来在细胞内过表达miRNA后，利用基因芯片分析mRNA的变化以找出相应miRNA的靶基因。这种方法由于miRNA所介导的转录后翻译抑制过程不引起mRNA水平的改变，因此依据mRNA水平的变化寻找miRNA靶基因的方法在检出率上存在一定问题。故采用蛋白质质谱的方法可以有效弥补这个不足。同时再结合miRNA靶基因的预测方法，可以大大提高了靶基因的检出率及可靠性。

    目前鉴定靶基因最直接的方法是，利用荧光定量PCR及Western blot方法分别检测转染或敲低miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化，从而确定miRNA与靶基因的对应关系。这种方法可以大大提高准确率，但最终确定靶基因，还需要鉴定miRNA的靶位点。

    而miRNA的靶位点的鉴定最常用的方法是荧光素酶报告基因法。其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体，将希望鉴定的miRNA靶基因的3′-UTR构建到荧光素酶基因的3′-UTR中，然后将荧光素酶基因表达载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平，最后检测荧光素酶的表达情况以分析转染3′-UTR中是否含有miRNA的靶位点。