足细胞培养条件,足细胞培养步骤

    

     （一）实验目的

     肾脏的主要功能之一是对血液的超滤作用，而肾小球滤过屏障是实现这一超滤作用的结构基础，其由内向外依次为毛细血管内皮细胞、肾小球基底膜以及位于肾小球足细胞（podocyte）和足突间的裂孔隔膜（slit diaphragm）。足细胞在肾小球疾病中处于中心调控作用，影响着多种肾小球疾病的发生和发展以及蛋白尿的形成。研究足细胞的生物学特性，阐明足细胞损伤的分子机制，对于寻求更为有效的治疗方法，延缓肾小球疾病的进展有重大意义。

     肾小球足细胞系的建立模拟了体内足细胞的发育过程，为进一步研究足细胞生物学功能及蛋白尿形成的分子机制提供很好的细胞模型。

     （二）来源

     小鼠条件永生化足细胞系（Mouse Podocyte cell 5，MPC5）来源于Mundel Laboratory。

     （三）器材准备

     33℃5%CO2孵箱，37℃5%CO2孵箱。

     （四）液体准备（表1-4至表1-9）

表1-4　103U/μlγ-Interferon（γ干扰素，IFN）

    

完全溶解后分装于灭菌1.5mlEP管中，-20℃冰箱保存

表1-5　足细胞培养液Ⅰ（100ml，33℃孵箱用）的配制

    

调pH至7.2，4℃贮存

表1-6　足细胞培养液Ⅱ（100ml，37℃孵箱用）的配制

    

调pH至7.2，4℃贮存

表1-7　0.02N乙酸（Aceticacid）的配制

    

表1-8　5mg/ml胶原I（Collagen-I）*的配制

    

*注意：使用时稀释成10μg/mlI型胶原溶液（蒸馏水），过0.22μmol/L滤器，过滤为无菌，足细胞在37℃分化时，1.5ml铺25cm2培养瓶，37℃放置1h后，无菌PBS清洗后使用

表1-9　消化液［含0.25%胰酶（Trysin）和0.04%EDTA］的配制

    

完全溶解后0.22μm滤器过滤灭菌

     另外还有无菌PBS溶液。

     （五）步骤

     1.复苏足细胞

     从液氮中取出一管冻存的小鼠足细胞MPC5。

     （1）立即置于37℃恒温水浴箱中水浴1～2min，轻轻晃动使细胞速融。

     （2）将细胞悬液移入了5ml足细胞培养液I的25cm×25cm培养瓶内，轻轻混匀。

     （3）置于33℃、5%CO2细胞培养箱内培养使其增殖。

     （4）隔天换液，达80%～85%融合（confluence）时传代细胞。

     2.传代足细胞

     （1）吸尽培养液后用5mlPBS轻轻漂洗细胞。

     （2）加1～1.5ml消化液，室温孵育2～3min，待细胞变圆轻轻拍打瓶底使细胞脱落，然后加2ml足细胞培养液I终止消化；并吹打细胞悬液6～8次使细胞呈单个。

     （3）将细胞悬液移至10ml无菌离心管中；离心：1300r，5min。

     （4）吸尽上清后用10ml足细胞培养液I重悬细胞沉淀，吹打细胞悬液6～8次使细胞呈单个。

     （5）细胞计数：细胞密度（细胞个数/ml）＝4大格细胞总数/4×104×稀释倍数。

     （6）每培养瓶内加5ml足细胞培养液I及适量细胞悬液（根据所需）。

     （7）轻轻混匀后置于33℃、5%CO2细胞培养箱内培养使其增殖。

     （8）隔天换液，达80%左右融合时冻存细胞。

     3.冻存足细胞

     （1）1～3同“传代足细胞”。

     （2）去尽上清后用4ml冻存液（90%FBS＋10%DMSO）重悬细胞沉淀，吹打细胞悬液6～8次以使细胞呈单个。

     （3）将细胞悬液移至1.5ml的冻存管内（1ml/管）。

     （4）置于冻存盒内放置于-20℃冰箱，2h移至-80℃冰箱，24h后转移至液氮中。

     4.足细胞分化态　培养取出一管冻存的MPC5复苏后于33℃、在10U/ml重组小鼠γ-IFN诱导下使其增殖；继而接种到涂有10μg/mlI型胶原的25cm×25cm培养瓶，于37℃培养1～2周使其分化成熟（一般用37℃培养7～14d的细胞），达70%～80%融合时进行下一步实验。

     （六）细胞镜下形态

     见图1-8，图1-9。

    

图1-8　33℃培养增殖（×200）

    

图1-9　37℃培养分化（×200）

     （七）注意事项

     虽然原则上认为，在33℃细胞增殖，37℃细胞分化，但足细胞系在37℃也生长。如果想分化的时间长一些，从33℃接种至37℃时应尽量细胞密度稀一些，可在37℃传一代之后再进行下一步实验。

     参考文献

     [1]Mundel P,Reiser J,Zúñiga Mejía Borja A,et al.Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.Exp Cell Res,1997,236:248-258.

     [2]Faul C,Donnelly M,Merscher-Gomez S,et al.The actin cytoskeleton of kidney podocytes is a direct target of the antiproteinuric effect of cyclosporine A.Nat Med,2008,14:931-938.