雅各布和莫诺的操纵子理论，是在研究大肠杆菌乳糖发酵的诱导本质的基础上提出来的。1967年，哈佛大学的吉尔伯特和米勒希尔利用阻遏蛋白超表达突变型细菌分离到了阻遏蛋白，并进而分离出阻遏蛋白的目标序列，即操纵基因。核苷酸序列分析表明，操纵基因包括28个碱基对，其中有一段回文序列，从而在分子水平上为操纵子学说提供了有力的证据。但是，人们认识自然现象的过程是永远不会完结的，对操纵子的认识也在不断深化。
我们知道，当大肠杆菌生长在以乳糖为唯一碳源和能源的培养基上时，乳糖操纵子被诱导而表达。要是在培养基中同时加入葡萄糖和乳糖，则乳糖操纵子并不表达。这是为什么？难道乳糖不起诱导物的作用了吗？
事实上莫诺的实验正是从这个现象开始的。当莫诺还是研究生时就做了一个实验。他让大肠杆菌生长于同时含有葡萄糖和乳糖的培养基上，细菌很快出现了一个对数生长期，其分裂世代周期为50 min，这是细菌在以葡萄糖为能源和碳源时的特征性世代周期。随后，细菌进入一个生长停滞期，时间为20 min左右。接着，细菌又进入第二个对数生长期，世代周期为80 min，这是以乳糖为能源和碳源时的特征性世代周期（图4-1）。酶活性测定也证实β半乳糖苷酶的活性只在细菌的第二个生长期才出现。莫诺对这个实验的解释是：在两种糖并存的培养基中，细菌先发酵葡萄糖而不顾乳糖的存在。生长停滞期表明培养基中的葡萄糖已耗尽。而只有当葡萄糖完全耗尽时，乳糖才能作为诱导物来诱导与乳糖发酵相关的酶的合成，细菌才能吸收、水解和利用乳糖。莫诺把这种现象称为“葡萄糖效应”。在整个20世纪50年代，莫诺和他的同事集中力量研究在不含葡萄糖的乳糖培养基上β半乳糖苷酶的诱导问题。一旦操纵子学说提出之后，莫诺就必须回过头来重新考虑葡萄糖效应。
是不是葡萄糖直接抑制了乳糖对β半乳糖苷酶的诱导呢？
曾经分离到大肠杆菌的一种双重突变型，它的一个突变是磷酸葡萄糖异构酶缺陷突变（pqi），另一个是6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺陷突变（zwf）。这种双重缺陷突变型细胞不能把6-磷酸葡萄糖转变为糖酵解途径中的下一个中间代谢物，所以它既不能直接利用葡萄糖，也不能利用水解产物是葡萄糖和半乳糖的乳糖作为碳源和能源。可是这种双重突变菌却能利用甘油作能源和碳源来进行并完成糖酵解的后半段的代谢途径。利用这种双重突变菌为实验材料作研究所得到的一个重要发现是，无论有还是没有葡萄糖的存在，异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）都能诱导细菌合成β半乳糖苷酶。这就清楚地表明在野生型细胞的葡萄糖效应中，抑制诱导物起诱导作用的并不是葡萄糖本身，而是葡萄糖在糖酵解中的某种代谢降解物。因而葡萄糖效应的实质是降解物阻遏。
图4-1 大肠杆菌在葡萄糖和乳糖同时存在的培养基上的生长曲线
造成降解物阻遏的降解物是什么还不清楚。但已经发现降解物阻遏是以环磷腺苷为间介的。环磷腺苷（cAMP）是1957年由萨瑟兰（E.Sutherland）发现的代谢次级信使。它由ATP经腺苷酸环化酶作用而生成，能参与真核多细胞生物代谢的激素调节反应。1965年，萨瑟兰发现cAMP还参与和激素调节无关的一些生化反应。他特别注意到了当培养基中的碳源耗尽时，即大肠杆菌细胞处于饥饿状态时，细胞内的cAMP含量非常高，而当细菌生长于含葡萄糖培养基时，cAMP浓度非常低。尽管能量代谢的水平怎样影响细胞内cAMP浓度还有待阐明，但至少可提出两种可能的研究工作假设。
（1）糖酵解过程中，某种在6-磷酸葡萄糖之后形成的中间代谢物，能抑制腺苷酸环化酶的活性，从而降低了由ATP转化为cAMP的速率。
（2）这种降解物刺激了磷酸二酯酶水解活性，使细胞内的cAMP因水解而减少。
帕斯坦（I.Pastan）和珀欧曼（R.Perlam）受萨瑟兰的工作启发，提出了cAMP是去除降解物阻遏的直接间介物。也就是说，cAMP的存在是解除降解阻遏物阻遏对乳糖操纵子诱导的必要条件，或者讲，葡萄糖降解产物是通过降低细胞内cAMP的水平而抑制乳糖酵解有关酶的合成的。为了证实上述假设，他们做了几个重要的实验。他们在迅速生长的细菌培养物中加入cAMP，即能解除降解物阻遏现象并诱导包括乳糖操纵子在内的几种诱导酶系统，但细菌生长速度会变慢。接着，他们用腺苷酸环化酶缺陷突变型细菌来研究诱导现象。因为突变菌不能将ATP环化为cAMP，细胞应处于永久的降解物阻遏状态，这样的细胞是不能发酵半乳糖、麦芽糖和阿拉伯糖的。腺苷酸环化酶缺陷突变型实际上也是一种广谱的糖酵解突变型，它在含有两种或两种以上糖的伊红亚甲蓝培养基上形成的克隆是白色的。与此相反，单种糖酵解缺陷突变（如Lacˉ，Araˉ等）能在含多种糖的伊红亚甲蓝培养基上形成和野生型细菌一样的红色菌落，因为任何一种单一种类的糖酵解突变型细菌至少能利用培养基中的另一种糖。帕斯坦和珀欧曼分离到了一些广谱糖酵解突变型细菌，生化分析证实其中有半数没有腺苷酸环化酶活性，所以也就没有cAMP。他们把因腺苷酸环化酶缺陷突变而造成cAMP缺乏的广谱糖酵解突变型称为第一类广谱糖酵解突变型细菌。
那么，另一半广谱糖酵解突变型细菌又会是什么样的突变型呢？或者说，第二类广谱糖酵解突变型细菌的缺陷在哪里呢？这一类细胞的腺苷酸环化酶是正常的，它们的细胞内是含有cAMP的。于是帕斯坦和珀欧曼又提出了一个新的假定，这部分广谱糖酵解突变型细胞缺乏一种特殊的蛋白质，这种蛋白质和cAMP一样，也是诱导有关的糖发酵酶时必不可少的间介物或参与者。野生型细胞和突变型细胞的比较生化研究证实了这个假设。他们在野生型细胞抽提液中发现了一种与cAMP结合在一起的蛋白质，称为降解物激活蛋白（catabolite activator protein，CAP）。而在第二类广谱糖酵突变型细胞中没有CAP，他们把CAP的缺失归之于突变基因crp，并用实验证明了cAMP和CAP对糖酵解酶的诱导作用是通过对有关操纵子mRNA转录的调控来实现的。
吉尔伯特和米勒希尔首次分离到LacI的产物阻遏蛋白后不久，就设计了一个有可能证实阻遏物作用的体外实验。他们用转导噬菌体λLac的DNA、RNA聚合酶和4种三磷酸核苷酸ATP、GTP、CTP和UTP（合称为NTP）组成一个反应系统，他们预期向这个系统加入阻遏物，将会降低RNA聚合酶以乳糖操纵子的结构基因为样板来转录信使RNA的速率，还预期在系统中加入异丙基硫代半乳糖苷，则会使mRNA合成速率得以恢复。可是实验结果使吉尔伯特和米勒希尔大失所望，无论他们加入阻遏物还是诱导物都影响不了那本来就少得可怜的一点点转录。这个实验失败的原因是由帕斯坦帮他们找到的。帕斯坦在这个反应系统中加入CAP和cAMP，结果乳糖操纵子的mRNA的转录大大增强了。他还证明只有当CAP和cAMP同时存在的情况下，阻遏物和诱导物才能表现出阻遏和诱导的作用。
对转录产物mRNA的核苷酸序列分析表明，其5′端的序列和DNA样板中LacO的序列相同，证实转录的起始点位于LacO区段内（而不是从结构基因LacZ的起始密码才开始转录，起始密码只是翻译的起点）。实验还表明这段mRNA还能和阻遏蛋白结合。由此可以设想，阻遏蛋白和操纵基因LacO结合时，实际上也覆盖了非常重要的转录起始点，从而阻断了转录过程。
利用CAP-cAMP复合物对其结合区段的保护作用，用DNA酶处理已和上述复合物结合的λLacDNA，获得了一段受复合物保护而未被DNA酶消化的DNA片段。核苷酸序列分析表明CAP-cAMP复合物结合区段是一个回文序列：
这和LacO序列是完全不同的，LacO的序列及回文区段为：
不久，又分离到了CAP-cAMP复合物结合区的两个影响转录速率的突变型L8和L29。这两个突变明显地降低了转录酶和促进子（LacP）区段的结合能力，进而降低了转录速率，称为低表达突变型（down mutant）。L8和L29这两个突变是同时属于CAP-cAMP复合物结合段和促进子的，表明复合物结合段是位于促进子内的一段有特殊功能的区段，以后的核苷酸序列分析也证实了这一点。
图4-2还表明和CAP-cAMP复合物结合位点邻接的是RNA聚合酶结合位点，该区段也曾分离到影响转录速率的突变型，如P′la和UV5是增加转录速率的高表达突变型（up mutant）。
把有关乳糖操纵子调控的知识综合起来，我们可以对它的结构与功能做一个小结。介于调节基因LacI最后一个密码子，和结构基因LacZ第一个密码子之间的共有122个碱基对。前面（5′端）的84个碱基对是促进子LacP，它包括两个结构上能互相区分的功能区：一是紧接Lac I基因的CAP-cAMP复合物结合区，二是RNA聚合酶的结合区。LacP的3′端和LacO的5′端有长度为3个碱基对的重叠区。操纵基因LacO是阻遏蛋白的结合区段，它和LacP的重叠区也是转录的起始点。为了使RNA多聚酶和LacP结合，CAP-cAMP复合物与LacP结合是必要的，其作用可能是导致双螺旋分子解旋，而使RNA多聚酶能到单链态的信息链上去。所以CAP或cAMP的缺如会抑制转录。当阻遏蛋白和LacO结合时，RNA聚合酶虽可与信息链结合，但不能进入转录起始点，这时整个乳糖操纵子的功能表达是受到阻遏的。
图4-2 大肠杆菌E.coli乳糖操纵子调控区段各特殊功能片段关系
十分清楚，乳糖操纵子的表达既受到遗传调控系统的正控制，又受到它的负控制。在正控制调节中，CAP-cAMP复合物使RNA聚合酶能结合于信息转录样板，在负控制调节中，LacI编码的阻遏蛋白通过和LacO的结合而阻止mRNA合成的起始。这一整套连续的调控序列使大肠杆菌乳糖操纵子的功能表达得到了几乎是“尽善尽美”的调节和控制。当培养基中有葡萄糖存在时，细菌是不必耗费能量来合成诱导酶的，这时细胞内的cAMP水平是低的，当葡萄糖耗尽，而又没有乳糖等其他糖时，细胞也不必耗能来合成无用的诱导酶，这时尽管cAMP水平增高，细胞也不会启动转录，只有在没有葡萄糖，但又存在乳糖时，乳糖操纵子才会启动并得到充分的表达。图4-3是乳糖操纵子在不同条件下的调控系统运作状况的示意图。
图4-3 大肠杆菌乳糖操纵子调控元件工作示意（引自wikimedia.org网）
乳糖操纵子的再分析，不仅使我们弄清了乳糖酵解酶诱导的全过程，也为深入研究其他的基因功能表达调控系统奠定了基础。
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